dna聚合酶的作用

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dna聚合酶的作用一:dna聚合酶的特点及其作用

　　DNA聚合酶(DNA polymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5"端点开始复制到3"端的酶。下面是百分网小编给大家整理的dna聚合酶的特点，希望能帮到大家!
　　dna聚合酶的特点
　　[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;
　　[2]需要模板和引物的存在;
　　[3]不能起始合成新的DNA链;
　　[4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3"-OH末端;
　　[5]催化DNA合成的方向是5"→3"。
　　dna聚合酶的作用
　　[1]聚合作用：在引物RNA"-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸
　　加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3"-OH与5"-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3"-5"外切酶活性位点所识别并切除之。
　　[2]3"→5"外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3"→5"方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3"→5"外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3"末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3"→5"外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3"→5"外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的3"→5"外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3"→5"外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，3"→5"外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。
　　[3]5"→3"外切酶活性──切除修复作用：5"→3"外切酶活性就是从5"→3"方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5"-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5"→3"。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5"→3"外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5"末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。
　　[4]焦磷酸解作用：DNApolⅠ的这种活性可以催化3"末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA
　　[5]焦磷酸交换作用：催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。
　　反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA
　　最后两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。
　　DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5"→3"外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nick translation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoIⅠ能从切口开始合成新的DNA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。
　　尽管DNApolⅠ是第一个被鉴定的DNA聚合酶，但它不是在肠杆菌中DNA复制的主要聚合酶。主要证据如下：
　　[1]纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DNA合成速率要比此高二倍数量级;
　　[2]大肠杆菌的一个突变株中，此酶的活力正常，但染色体DNA复制不正常;
　　[3]而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA复制却正常，而且此突变株增加了对紫外线、烷化剂等突变因素的敏感性。这表明该酶与DNA复制关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用。
　　实验室常用的耐热DNA聚合酶
　　耐热DNA聚合酶多应用在PCR技术中。各种耐热DNA聚合酶均具有5"-3"聚合酶活性，但不一定具有3"-5"和5"-3"的外切酶活性。3"-5"外切酶活性可以消除错配，切平末端;5"-3"外切酶活性可以消除合成障碍。由于上述这些不同，可以将耐热DNA聚合酶分为三类：
　　一、普通耐热DNA聚合酶
　　Taq DNA 聚合酶
　　由一种水生栖热菌yT1株分离提取出，是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，达200,000单位/mg。具有5"-3"外切酶活性，但不具有3"-5"外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。
　　TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3"加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3"突出的单A核苷酸尾;另一方面，在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3"端加入单T核苷酸尾，产生3"端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。
　　Tth DNA 聚合酶
　　从Thermus thermophilus HB8中提取而得，该酶在高温和MnCl2条件下，能有效地逆转录RNA;当加入Mg2+后，该酶的聚合活性大大增加，从而使cDNA合成与扩增可用一种酶催化。
　　二、高保真DNA聚合酶
　　pfu DNA 聚合酶
　　是从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5"-3"外切酶活性，但具有3"-5"外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无3"端突出的单A核苷酸。
　　Vent DNA 聚合酶
　　该酶是从Litoralis栖热球菌中分离出的，不具有5"-3"外切酶活性，但具有3"-5"外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能。
　　三、DNA序列测定中应用的耐热DNA聚合酶
　　Promega公司测序级TaqDNA聚合酶
　　是在TaqDNA聚合酶的基础上对它进行修饰，去除5"-3"外切酶活性，保证测序记过的高度准确性，可产生强度均一的测序条带，背景清晰。
　　Bca Best DNA 聚合酶
　　从Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提纯，并使其5"-3"外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸长性能优越;可抑制DNA二级结构形成，可以得到均一的DNA测序带。
　　Sac DNA 聚合酶
　　从酸热浴流化裂片菌中分离，无3"-5"外切酶活性，可用于DNA测序，但测序反应中ddNTP/dNTP的比率要高。

dna聚合酶的作用二:高中生物选修3重点知识点归纳

　　你熟悉选修三的生物课本内容吗?知道这本书都讲了哪些知识点吗?其实选修三主要是介绍了一些重要的生物科学技术。下面是百分网小编为大家整理的高中生物知识要点总结，希望对大家有用!
　　高中生物选修三知识
　　基因工程
　　基因工程：是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
　　(一)基因工程的基本工具
　　1. “分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
　　(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
　　(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
　　(3)结果：
　　经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
　　2. “分子缝合针”——DNA连接酶
　　(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较：
　　①相同点：都缝合磷酸二酯键。
　　②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
　　(2)与DNA聚合酶作用的异同：
　　DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
 
 
DNA连接酶
DNA聚合酶
不同点
连接的DNA
双链
单链
模板
不要模板
要模板
连接的对象
2个DNA片段
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上
相同点
作用实质
形成磷酸二酯键
化学本质
蛋白质
　　3. “分子运输车”——载体
　　(1)载体具备的条件：
　　①能在受体细胞中复制并稳定保存。
　　②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
　　③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
　　(2)最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
　　(3)其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
　　选修三生物必备知识
　　基因工程的基本操作程序
　　第一步：目的基因的获取
　　1. 目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。
　　2. 原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
　　3. PCR技术扩增目的基因
　　(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
　　(2)目的：获取大量的目的基因
　　(3)原理：DNA双链复制
　　(4)过程：
　　第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链;
　　第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合;
　　第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
　　(5)特点：指数(2n)形式扩增
　　第二步：基因表达载体的构建(核心)
　　1. 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
　　2. 组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
　　(1)启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
　　(2)终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
　　(3)标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
　　第三步：将目的基因导入受体细胞
　　1. 转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
　　2. 常用的转化方法：
　　将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
　　将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。
　　将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌 ，其转化方法是：
　　先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
　　3. 重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
　　第四步：目的基因的检测和表达
　　1. 首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交(DNA-DNA)技术。
　　2. 其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交(DNA-RNA)技术。
　　3. 最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
　　4. 有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫或抗病的鉴定等。
　　高中选修一生物知识
　　DNA的粗提取与鉴定
　　提取DNA的溶解性原理包括DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精。
　　DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度的特点：在0.14mol/L时溶解度最小;要使DNA溶解，需要较高浓度?要使DNA析出，又需要0.14mol/L的浓度?
　　在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液;将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精(特别是95%冷却酒精)，但细胞中蛋白质可溶于酒精。
　　从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解;二是降低分子运动，易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
　　采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到的目的是：将DNA和蛋白质进一步分离。
　　提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。
　　补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。
　　当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定?
　　答：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。
　　原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA;再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的;最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。
　　实验材料的选取：
　　不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
　　本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得;二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。
　　鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。
　　破碎细胞，获取含DNA的滤液：
　　若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液?
　　答：在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液;切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。
　　为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
　　答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

dna聚合酶的作用三:高三生物重要知识点归纳大全

　　我们都知道，虽然生物是理科中的一项，但是高三的时候，学习生物还是以识记理解知识点为主。下面是百分网小编为大家整理的高三生物知识归纳，希望对大家有用!
　　高三生物知识点归纳
　　一、细胞膜
　　(1)组成：主要为磷脂双分子层 (基本骨架)和蛋白质 ，及少量糖类。(其他具膜的细胞结构的膜成分与之相似)
　　(2)结构特点：具有一定的流动性 (原因：磷脂和蛋白质的运动); 功能特点：具有选择通透性 。
　　(3)功能：保护 和控制物质进出 ;细胞间信息传递、识别、免疫(膜上的糖蛋白)
　　(4)细胞膜的制备：原理：渗透作用(将细胞放在清水中会吸水涨破，内容物流出，得到细胞膜);取材：人或其它哺乳动物新鲜的成熟的红细胞(无细胞核和众多细胞器)稀释液(血液加适量生理盐水); 提纯方法：差速离心法;
　　二、细胞壁：植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶 ，有支持 和保护 功能;细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成
　　三、细胞质(细胞膜以内、细胞核以外的部分，叫细胞质——均匀透明的胶状物质，包括细胞质基质和细胞器)
　　(1)细胞质基质：为代谢提供场所和物质和一定的环境条件，影响细胞的形状、分裂、运动及细胞器的转运等。含有水、无机盐、脂质、糖类、蛋白质、氨基酸、核苷酸等)
　　(2)细胞器： 线粒体(双层 膜)：内膜向内突起形成“嵴”(可增大膜面积)，细胞有氧呼吸 的主要场所(第二、三 阶段)，含少量DNA和RNA。 用健那绿染液染呈蓝绿色，用铁苏木精染色呈蓝色。
　　叶绿体(双层 膜)：只存在于植物的绿色细胞中。类囊体(可增大膜面积)上有色素，类囊体 和基质 中含有与光合作用有关的酶，是光合作用 的场所。(注意区分光反应与暗反应的具体场所)含少量的DNA和RNA 。
　　内质网(单层 膜)：是有机物 的合成“车间”，蛋白质 运输的通道。
　　高尔基体(单层膜囊状结构)：动物细胞中与分泌物 的形成有关(可形成囊泡)，植物中与有丝分裂细胞壁 的形成有关。常在抗体的分泌、植物的有丝分裂中考到。
　　液泡(单层膜)：泡状结构，成熟的植物有大液泡。功能：贮藏(营养、色素等)、保持细胞形态，调节渗透吸水。 核糖体(无膜结构)：合成蛋白质 的场所。由蛋白质和rRNA组成。将氨基酸缩合成肽链，蛋白质的“装配机器”。
　　中心体(无膜结构)：由垂直的两个中心粒构成，与动物和低等植物 细胞的有丝分裂 有关(间期复制)。
　　溶酶体：(单层膜)：含多种水解酶，常考效应T细胞能和靶细胞密切接触，激活靶细胞内的溶酶体酶，使靶细胞裂解
　　小结： 双层膜的细胞器：线粒体 、叶绿体 ; 单层膜的细胞器：内质网 、高尔基体 、液泡等 ;
　　非膜的细胞器：核糖体 、中心体 ; 含有少量DNA和RNA(能复制和转录)的细胞器：线粒体 、叶绿体 ;
　　含有色素的细胞器：叶绿体、液泡;动、植物细胞的区别：动物特有中心体;高等植物特有细胞壁、叶绿体、液泡。
　　高三生物必备知识
　　一、 基因工程
　　1、(a)基因工程的诞生
　　(一)基因工程的概念
　　基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
　　2、(a)基因工程的原理及技术
　　原理：基因重组
　　技术：(一)基因工程的基本工具
　　1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
　　(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
　　(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
　　(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
　　2.“分子缝合针”——DNA连接酶
　　(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。
　　②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
　　(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
　　3.“分子运输车”——载体
　　(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
　　(2)最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
　　(3)其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒
　　高三生物知识点
　　1 细胞是生物体结构和功能的基本单位
　　2.生命系统的结构层次是 生物圈、生态系统、群落、种群、个体、 系统、器官、组 织、细胞。
　　3 .核细胞：分为细胞膜、细胞质、拟核(无核膜，并不是真正的细胞核)[大肠杆菌/ 肺炎双球菌/硝化细菌]
　　4 .核细胞：分为细胞膜、细胞质、细胞核等[水绵-绿藻/伞藻/草履虫/变形虫//酵母菌/ 蛔虫]
　　5 .学家根据有无以核膜为界限的细胞核,将细胞分为原核细胞和真核细胞 原核细胞 细胞壁 核结构 细胞器 染色体 种类 较小(1-10 微米) 没有成形的细胞核，组成核的物 质集中在拟核，无核膜、核仁 核糖体 无 原核生物(细菌、放线菌、蓝藻) 真核细胞 较大(10-100 微米) 有成形的细胞核，组成核的物质集 中在拟核，有核膜、核仁 多种细胞器 有 真核生物(植物、动物、真菌-蘑菇)
　　6 .学显微镜的操作步骤：对光→低倍物镜观察(视野亮)→移动视野中央(偏左移左) →高倍物镜观察(视野暗) ：①只能调节细准焦螺旋;②调节大光圈、凹面镜
　　7 .胞学说建立者是施莱登和施旺， 细胞学说建立揭示了细胞的统一性和生物体结构的 统一性。细胞学说建立过程，是一个在科学探究中开拓、继承、修正和发展的过程，充满耐 人寻味的曲折。

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